Development of novel bioanalytical assays with single-molecule readout for biomarker detection and drug candidate characterization
Doctoral thesis, 2017
Bioanalytical assays with single-molecule readout for studying molecular interactions have in the past decades received increasing attention. The high sensitivity often offered by this readout scheme has for example enabled ultra-sensitive analyte detection, having important implications for monitoring early disease progression and the effects of drug treatment. In addition, single-molecule studies of molecular interactions with membrane protein receptors have proven useful for the development of new and more effective drugs. Ultra-sensitive detection as well as the possibility to unravel heterogeneities in molecular interactions, offered by single-molecule readout schemes, are both key components for the future of personalized health care and the discovery of new disease biomarkers.
This thesis mainly focuses on the development of new bioanalytical assays with single-molecule readout, with the purpose to enable studies of molecular interactions with membrane protein receptors (an important class of drug targets) and to detect diagnostically relevant biomarkers and pathogens. Lipid assemblies, either in the form of liposomes or supported lipid bilayers, have been exploited for their compatibility and flexibility offered in the context of studying many essential biological interactions. In the first part of the thesis, two surface-based assays, both utilizing total internal fluorescence (TIRF) microscopy, were developed to study molecular interactions with a low-abundant and sensitive class of membrane proteins; G protein-coupled receptors (GPCRs). With the insights gained from that work, the focus was shifted towards solution-based detection schemes, based on a home-built dual-color fluorescence microscopy setup. Two detection schemes, based on Förster resonance energy transfer (FRET), for biomarker detection (phospholipase and miRNA), and a third scheme for detection of virus particles via induced colocalization of fluorescent liposomes, were developed.
As for future perspectives the thesis puts emphasis on how the different bioanalytical assays can have implications for personalized health care and how the performance of the solution-based colocalization assay can be further improved to become a generic tool for biosensing purposes.
QCM-D
biomarker detection
TIRF microscopy.
Bioanalytical assay
spectrofluorometry
fluorescence
single-molecule readout
drug discovery
liposomes
Kollektorn, MC2, Kemivägen 9, Chalmers Tekniska Högskola
Opponent: Prof. Jerker Widengren, Institutionen för tillämpad fysik, KTH - Kungliga tekniska högskolan, Stockholm, Sverige
Author
Olov Wahlsten
Chalmers, Physics, Biological Physics
I våra kroppar sker varje ögonblick ett mycket stort antal interaktioner mellan biologiska molekyler. Dessa interaktioner är nödvändiga för att upprätthålla alla biologiska processer, vilket i sin tur är av yttersta vikt för att vi ska må bra och hålla hälsan. Studiet av dessa interaktioner är inte bara viktigt för att nå en fördjupad förståelse för komplexa biologiska system, såsom vår egen människokropp, utan också för att bidra till en ökad insikt om de sjukdomar som kan drabba oss. Andra viktiga aspekter av att studera biomolekylära interaktioner är i syfte att utveckla nya, mer effektiva och i förlängningen personligt anpassade läkemedel, samt att finna nya molekyler vars förekomst skvallrar om att ett visst sjukdomstillstånd föreligger; så kallade biomarkörer.
För att kunna studera interaktioner mellan biomolekyler eller att i diagnostiskt syfte detektera förekomsten av en viss biomolekyl i ett prov används så kallade bioanalytiska sensorer. Dessa sensorer består, per definition, av tre olika komponenter; ett element utformat för att känna igen den biomolekyl man ämnar finna, ett element som vid denna igenkänningen sänder ut en mätbar signal, samt en anordning som mäter denna signal och presenterar resultatet på ett begripligt sätt för användaren. Idag finns en uppsjö av dessa olika biosensorer, där valet av sensor beror på aspekter så som vilken den eftersökta biomolekylen är och vilken grad av förekomst (koncentration) den förväntas ha i provet. Två välkända exempel, mycket tack vare deras breda användande och tillgänglighet, är graviditetstestet och glukosmätaren.
I denna avhandling har nya metoder för att studera biomolekylära interaktioner utvecklats. I första delen har fokus varit att utveckla metoder som är kompatibla med en viktig grupp av proteiner som återfinns i det membran som omger cellen, kallade G-protein-kopplade receptorer (GPCR:er). Eftersom deras naturliga funktion är att känna av cellens yttre miljö och kommunicera detta till cellens inre, vilket är en förutsättning för att cellen ska kunna initiera en fysiologisk respons av detta yttre stimuli, har denna grupp av membranproteiner visat sig vara högst intressanta ur ett läkemedelsperspektiv. GPCR:er har dock visat sig vara svåra att studera, dels för att det i varje cell finns ytterst få och dels eftersom de är mycket känsliga för förändringar i sin närmaste omgivning, vilket försvårat användandet av konventionella metoder för att studera dem.
I den andra delen av avhandlingen utvecklades en helt ny instrumentell plattform för att samtidigt kunna studera nanopartiklar av två olika färger direkt i lösning. Två olika diagnostiska koncept, som båda baserats på denna plattform och de färgade nanopartiklarna, utvecklades för att detektera en biomarkör för t.ex. Alzheimers och ischemisk stroke och en för influensa-infektion. Även ett tredje koncept utvecklades, återigen baserat på samma plattform, för att enkelt och snabbt detektera viruspartiklar vid väldigt låga koncentrationer. I avhandlingens sista kapitel föreslås hur denna metod skulle kunna förbättras för att bli ännu känsligare och även kunna bidra inom andra medicinska och diagnostiska applikationsområden.
För att kunna studera interaktioner mellan biomolekyler eller att i diagnostiskt syfte detektera förekomsten av en viss biomolekyl i ett prov används så kallade bioanalytiska sensorer. Dessa sensorer består, per definition, av tre olika komponenter; ett element utformat för att känna igen den biomolekyl man ämnar finna, ett element som vid denna igenkänningen sänder ut en mätbar signal, samt en anordning som mäter denna signal och presenterar resultatet på ett begripligt sätt för användaren. Idag finns en uppsjö av dessa olika biosensorer, där valet av sensor beror på aspekter så som vilken den eftersökta biomolekylen är och vilken grad av förekomst (koncentration) den förväntas ha i provet. Två välkända exempel, mycket tack vare deras breda användande och tillgänglighet, är graviditetstestet och glukosmätaren.
I denna avhandling har nya metoder för att studera biomolekylära interaktioner utvecklats. I första delen har fokus varit att utveckla metoder som är kompatibla med en viktig grupp av proteiner som återfinns i det membran som omger cellen, kallade G-protein-kopplade receptorer (GPCR:er). Eftersom deras naturliga funktion är att känna av cellens yttre miljö och kommunicera detta till cellens inre, vilket är en förutsättning för att cellen ska kunna initiera en fysiologisk respons av detta yttre stimuli, har denna grupp av membranproteiner visat sig vara högst intressanta ur ett läkemedelsperspektiv. GPCR:er har dock visat sig vara svåra att studera, dels för att det i varje cell finns ytterst få och dels eftersom de är mycket känsliga för förändringar i sin närmaste omgivning, vilket försvårat användandet av konventionella metoder för att studera dem.
I den andra delen av avhandlingen utvecklades en helt ny instrumentell plattform för att samtidigt kunna studera nanopartiklar av två olika färger direkt i lösning. Två olika diagnostiska koncept, som båda baserats på denna plattform och de färgade nanopartiklarna, utvecklades för att detektera en biomarkör för t.ex. Alzheimers och ischemisk stroke och en för influensa-infektion. Även ett tredje koncept utvecklades, återigen baserat på samma plattform, för att enkelt och snabbt detektera viruspartiklar vid väldigt låga koncentrationer. I avhandlingens sista kapitel föreslås hur denna metod skulle kunna förbättras för att bli ännu känsligare och även kunna bidra inom andra medicinska och diagnostiska applikationsområden.
Driving Forces
Sustainable development
Subject Categories
Physical Sciences
Biological Sciences
Biophysics
Chemical Sciences
ISBN
978-91-7597-606-8
Doktorsavhandlingar vid Chalmers tekniska högskola. Ny serie: 4287
Publisher
Chalmers
Kollektorn, MC2, Kemivägen 9, Chalmers Tekniska Högskola
Opponent: Prof. Jerker Widengren, Institutionen för tillämpad fysik, KTH - Kungliga tekniska högskolan, Stockholm, Sverige