DNA and RNA base analogue FRET - from fluorophore design to biochemical applications

Doctoral thesis, 2018

DNA och RNA är extremt viktiga molekyler. De finns i våra celler, och är en central del av maskineriet som håller oss friska. När något går fel i cellmaskineriet är det ofta förödande. För att förstå hur celler fungerar och för att kunna förebygga eller bota vissa sjukdomar behöver vi ökad förståelse för både DNA och RNA och hur de beter sig under olika förhållanden. En stor mängd kunskap har samlats in de senaste decennierna men det finns fortfarande mycket kvar att förstå. En stor bit av det fortfarande ofullständiga pusslet handlar om att förstå deras tre-dimensionella struktur, deras dynamik och hur de interagerar med andra molekyler. Denna avhandling handlar om hur korta DNA- och RNA-bitar kan göras fluorescenta (självlysande) med hjälp av så kallade basanaloger och hur dessa kan användas för att studera DNA- och RNA-strukturerna och deras interaktioner med andra molekyler. 

Fluorescens är ett attraktivt verktyg för att studera biologiskt relevanta molekyler eftersom det är relativt lättillgängligt, kan användas på molekyler i vattenlösning och möjliggör mätningar i realtid. DNA och RNA är i sig själva inte fluorescenta och måste därför märkas med fluorescenta molekyler. Fokus i denna avhandling ligger på att utveckla och studera märkning med fluorescenta basanaloger, dessa är så lika de naturliga baserna i DNA och RNA så att de kan användas utan att strukturen eller funktionen hos DNA och RNA påverkas. Eftersom basanalogen befinner sig inne i själva DNA- eller RNA-molekylen kan den, om den har rätt egenskaper, rapportera om små förändringar i strukturen eller omgivningen.

Denna avhandling fokuserar extra på utveckling av basanaloger som möjliggör mätning av energiöverföring mellan dem. Energiöverföringen kan mätas med fluorescens och är starkt beroende av avstånd och vinkel mellan basanalogerna. Detta innebär att mängden energiöverföring kan ge information om förändringar i avstånd och vinkel mellan basanalogerna och därmed indirekt om förändringar i DNA- och RNA-strukturen också. När arbetet med avhandlingen påbörjades fanns endast ett sådant basanalogpar tillgängligt för DNA och inget för RNA. I detta arbete presenteras tre nya par för DNA och dessutom introduceras också det första paret för RNA. Introduktionen av denna metod för RNA är viktigt då RNA har en mer varierad tre-dimensionell struktur med mycket dynamik jämfört med DNA. Det pågår intensiv forskning angående RNA-baserade mediciner och förhoppningsvis kan basanaloger hjälpa utvecklingen av dem framåt. I avhandlingen exemplifieras möjligheterna med energiöverföring mellan basanaloger med en studie av hur strukturen av DNA-helixen ändras när netropsin, en liten polyamid med antibiotiska egenskaper, binder till DNA samt en studie på förändringen i energiöverföring när dubbelsträngat RNA ändras från en höger- till en vänster-vriden helix.