Competitive-Binding Based Optical DNA Mapping - From Bacterial Plasmids to the Human Genome
Doctoral thesis, 2020
Significant advances within the field of DNA sequencing have allowed us to study DNA at a level of detail that was previously impossible. However, dynamic genomic regions with a high degree of structural variations, while being linked to disease in humans and increased resistance to antibiotics, are still challenging to characterize. Furthermore, DNA sequencing for bacterial diagnostics and detection of resistance genes is presently hampered by the excessive lead times associated with the overall complexity of the applied methods.
This Thesis describes the development of novel assays based on optical DNA mapping, which, although studying DNA at a lower resolution, is capable of rapid processing of significantly larger DNA fragments compared to sequencing. The fluorescent labeling in the assays presented here relies on competitive DNA binding between the emissive YOYO-1 and the sequence-specific, non-emissive, netropsin. The labeled DNA is then stretched in nanofluidic channels and imaged using fluorescence microscopy, enabling extraction of coarse-grained sequence information from ultralong DNA molecules at the single-molecule level.
The results demonstrate how competitive binding-based optical DNA mapping can be used to characterize and trace bacterial DNA, responsible for the spread of antibiotic resistance. The mapped bacterial DNA can also be used to identify bacterial species in complex mixtures and directly from clinical samples. Additionally, so-called long-range sequence information of the human genome can be obtained, with possible future applications including detection of disease-related structural variations and epigenetic profiling.
This Thesis describes the development of novel assays based on optical DNA mapping, which, although studying DNA at a lower resolution, is capable of rapid processing of significantly larger DNA fragments compared to sequencing. The fluorescent labeling in the assays presented here relies on competitive DNA binding between the emissive YOYO-1 and the sequence-specific, non-emissive, netropsin. The labeled DNA is then stretched in nanofluidic channels and imaged using fluorescence microscopy, enabling extraction of coarse-grained sequence information from ultralong DNA molecules at the single-molecule level.
The results demonstrate how competitive binding-based optical DNA mapping can be used to characterize and trace bacterial DNA, responsible for the spread of antibiotic resistance. The mapped bacterial DNA can also be used to identify bacterial species in complex mixtures and directly from clinical samples. Additionally, so-called long-range sequence information of the human genome can be obtained, with possible future applications including detection of disease-related structural variations and epigenetic profiling.
genetics
single-molecule
nanofluidics
DNA
antibiotic resistance
optical DNA mapping
plasmids
competitive binding
fluorescence microscopy
bacteria
Author
Vilhelm Müller
Chalmers, Biology and Biological Engineering, Chemical Biology
Rapid Tracing of Resistance Plasmids in a Nosocomial Outbreak Using Optical DNA Mapping
ACS Infectious Diseases,;Vol. 2(2016)p. 322-328
Journal article
Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR/Cas9 in combination with optical DNA mapping.
Scientific Reports,;Vol. 6(2016)p. 37938-
Journal article
Cultivation-Free Typing of Bacteria Using Optical DNA Mapping
ACS Infectious Diseases,;Vol. 6(2020)p. 1076-1084
Journal article
Enzyme-free optical DNA mapping of the human genome using competitive binding
Nucleic Acids Research,;Vol. 47(2019)
Journal article
Deoxiribonukleinsyra, mer känt som DNA, fungerar som instruktionsmanualen för i stort sett allt liv på jorden. DNA-molekyler lagrar den information som sedan talar om för våra celler hur de ska se ut. Till skillnad från vårt alfabet lagrar DNA information genom långa sekvenser av enbart fyra bokstäver (baserna A, T, G och C). För att bättre förstå hur vi människor och andra levande organismer fungerar har metoder skapats för att kunna läsa sekvensen hos DNA. I början av 2000-talet lyckades forskare med den otroliga bedriften att sekvensera ett helt mänskligt genom, bestående av över 3 miljarder baspar. Då den kompletta sekvensen är för lång för att läsas i ett svep, bryts de långa DNA-molekylerna sönder i mindre bitar innan sekvensering görs. Varje bit sekvenseras sedan var för sig och den intakta sekvensen återskapas genom att försöka pussla ihop alla bitar igen.
Även om utvecklingen av DNA sekvensering har gått kraftigt framåt de senaste 20 åren är processen i många fall fortfarande kostsam, tidskrävande och komplex, och det slutgiltiga resultatet inte alltid korrekt. I den här avhandlingen beskrivs utvecklingen av en kompletterande metod till DNA sekvensering där DNA sekvensen studeras i mindre detalj, men över mycket större längdskalor. Metoden bygger på att extrahera långt DNA som sedan med hjälp av två sorters små molekyler får ett sekvensspecifikt ”självlysande” randigt mönster, likt en streckkod. DNA-molekylerna sträckts sedan ut i kanaler som är tusen gånger tunnare än ett hårstrå och studeras med hjälp av mikroskopi. På så sätt kan information erhållas på längdskalor som traditionellt sätt inte är tillgängliga vid DNA sekvensering.
Den sekvensbaserade streckkoden har många olika potentiella användningsområden. I den här avhandlingen beskrivs hur antibiotikaresistenta bakterier kan identifieras och spridning spåras genom att analysera bakteriernas DNA. Avhandlingen beskriver även hur metoden kan användas för att studera det mänskliga genomet för att i framtiden detektera förändringar hos DNA som är direkt kopplat till genetiska sjukdomar.
Även om utvecklingen av DNA sekvensering har gått kraftigt framåt de senaste 20 åren är processen i många fall fortfarande kostsam, tidskrävande och komplex, och det slutgiltiga resultatet inte alltid korrekt. I den här avhandlingen beskrivs utvecklingen av en kompletterande metod till DNA sekvensering där DNA sekvensen studeras i mindre detalj, men över mycket större längdskalor. Metoden bygger på att extrahera långt DNA som sedan med hjälp av två sorters små molekyler får ett sekvensspecifikt ”självlysande” randigt mönster, likt en streckkod. DNA-molekylerna sträckts sedan ut i kanaler som är tusen gånger tunnare än ett hårstrå och studeras med hjälp av mikroskopi. På så sätt kan information erhållas på längdskalor som traditionellt sätt inte är tillgängliga vid DNA sekvensering.
Den sekvensbaserade streckkoden har många olika potentiella användningsområden. I den här avhandlingen beskrivs hur antibiotikaresistenta bakterier kan identifieras och spridning spåras genom att analysera bakteriernas DNA. Avhandlingen beskriver även hur metoden kan användas för att studera det mänskliga genomet för att i framtiden detektera förändringar hos DNA som är direkt kopplat till genetiska sjukdomar.
Areas of Advance
Nanoscience and Nanotechnology
Subject Categories
Physical Chemistry
Microbiology
Nano Technology
ISBN
978-91-7905-169-3
Doktorsavhandlingar vid Chalmers tekniska högskola. Ny serie: 4636
Publisher
Chalmers