Nanofluidics for Static and Dynamic DNA-Protein Interaction Studies - Repair of Double-Strand Breaks from a Single-Molecule Perspective

Doctoral thesis, 2020

I cellkärnan finns vår genetiska arvsmassa som ligger till grund för utvecklingen av cellen och dess olika egenskaper, samt formar oss till unika individer. Arvsmassan utgörs av DNA-molekyler som kan liknas vid långa kedjor, där varje länk motsvarar ett specifikt kvävebaspar. De fyra naturliga DNA-kvävebaserna; adenin, cytosin, guanin och tymin länkas ihop i en unik ordningsföljd, var i den genetiska informationen finns lagrad. Totalt består det mänskliga genomet av cirka tre miljarder baspar som har packats ihop till kromosomer i cellkärnan.
         DNA-molekylen utsätts ständigt för påfrestningar som kan ge upphov till skador. Faktum är att arvsmassan i en mänsklig cell kan skadas upp till 100 000 gånger per dag. Så kallade dubbelsträngsbrott, där DNA-kedjan har gått av, utgör en av de farligaste typerna av skador då endast ett brott i hela molekylen kan orsaka omedelbar celldöd. Lyckligtvis har evolutionen utvecklat en armé av proteiner som ständigt arbetar för att detektera och eliminera dubbelsträngsbrott. Kunskap om hur dessa proteiner arbetar i cellen är avgörande för att förstå hur olika sjukdomar kan uppstå, samt för utvecklingen av nya behandlingsmetoder mot exempelvis cancer.
         I denna avhandling har reparation av dubbelsträngsbrott undersökts på molekylär nivå för att få en djupare inblick i hur specifika proteiner agerar då DNA-kedjan har gått av. Genom att tvinga in DNA i små kanaler, cirka tusen gånger smalare än diametern på ett hårstrå, är det möjligt att sträcka ut enskilda molekyler utan att hålla fast i ändarna. Därmed kan man visualisera hur olika proteiner binder till ändarna för att påbörja reparation av brottet. På så vis har vi lyckats identifiera en tidigare okänd potentiell funktion hos CtIP, ett protein som är nödvändigt för reparation av dubbelsträngsbrott i mänskliga celler. Vi har även studerat proteinet Ku som är en kritisk komponent, hos såväl människor som bakterier, i försvaret mot DNA-skador. För att även kunna studera dynamiska DNA-protein-interaktioner i realtid har vi vidareutvecklat de så kallade nanokanalerna för att möjliggöra aktiv tillförsel av proteiner till de utsträckta DNA-molekylerna. Avhandlingen i sin helhet sammanfattar några av de senaste framstegen som gjorts i syfte att förstå de invecklade DNA-reparationsprocesserna, vilket i förlängningen kan möjliggöra utvecklingen av nya och mer effektiva behandlingsmetoder mot exempelvis cancer.