Nanofluidics for Static and Dynamic DNA-Protein Interaction Studies - Repair of Double-Strand Breaks from a Single-Molecule Perspective
Doktorsavhandling, 2020

Double-strand breaks (DSBs) is one of the most lethal forms of DNA damage. A single DSB may result in stalling of vital cellular machineries, and thus, requires immediate measures by the cell. Although the main hallmarks of DSB repair mechanisms are known for most prokaryotes and eukaryotes, details on crucial intermediate steps are still to be explained, such as how the free DNA ends are kept in close proximity during the repair process.
         In the original work, upon which this Thesis is based, the two main DSB repair mechanisms, homologous recombination (HR) and non-homologous end-joining (NHEJ), have been studied from a molecular perspective. A fluorescence-based single-molecule nanofluidics assay has been developed and employed to characterize and visualize static biomolecular interactions between DNA and key DSB repairing proteins. Furthermore, a novel dynamic nanofluidic device has been developed to enable dynamic interaction studies in real time, allowing analytes to be introduced on-demand to stretched DNA molecules.
         Single-molecule characterization of the NHEJ mechanism in Bacillus subtilis, comprising the Ku and Ligase D proteins, revealed that the end-joining activity is mediated by C-terminal protrusions on the homodimeric Ku complex. Using the novel dynamic nanofluidic device, the Ku homodimer was further demonstrated to stay bound to the DNA ends and junctions after completed repair, similar to the human Ku70/80 heterodimer. In addition, the traditional static nanofluidic device was used to identify a previously unknown potential DNA-bridging role of CtIP, a key protein in the human HR process. This could possibly explain how broken DNA ends are kept in close proximity during the initial steps of DSB repair through HR in humans. A similar method was employed to show that the Xrs2 component is indispensable for the end-joining activity of the Mre11-Rad50-Xrs2 complex of Saccharomyces cerevisiae.

HR

Biomolecule interactions

Fluorescence

Microscopy

Nanofluidics

Protein

NHEJ

Single-molecule

DNA repair

Dynamic

HA1-salen, Hörsalsvägen 4.
Opponent: Prof. Erwin J. G. Peterman, Department of Physics and Astronomy, Vrije Universiteit, Netherlands

Författare

Robin Öz

Chalmers, Biologi och bioteknik, Kemisk biologi

Dynamics of Ku and Bacterial Non-Homologous End-Joining Characterized Using Single DNA Molecule Analysis

Phosphorylated CtIP bridges DNA to promote annealing of broken ends

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,; Vol. 117(2020)p. 21403-21412

Artikel i vetenskaplig tidskrift

Xrs2 is crucial for DNA bridging by the Mre11-Rad50-Xrs2 complex

I cellkärnan finns vår genetiska arvsmassa som ligger till grund för utvecklingen av cellen och dess olika egenskaper, samt formar oss till unika individer. Arvsmassan utgörs av DNA-molekyler som kan liknas vid långa kedjor, där varje länk motsvarar ett specifikt kvävebaspar. De fyra naturliga DNA-kvävebaserna; adenin, cytosin, guanin och tymin länkas ihop i en unik ordningsföljd, var i den genetiska informationen finns lagrad. Totalt består det mänskliga genomet av cirka tre miljarder baspar som har packats ihop till kromosomer i cellkärnan.
         DNA-molekylen utsätts ständigt för påfrestningar som kan ge upphov till skador. Faktum är att arvsmassan i en mänsklig cell kan skadas upp till 100 000 gånger per dag. Så kallade dubbelsträngsbrott, där DNA-kedjan har gått av, utgör en av de farligaste typerna av skador då endast ett brott i hela molekylen kan orsaka omedelbar celldöd. Lyckligtvis har evolutionen utvecklat en armé av proteiner som ständigt arbetar för att detektera och eliminera dubbelsträngsbrott. Kunskap om hur dessa proteiner arbetar i cellen är avgörande för att förstå hur olika sjukdomar kan uppstå, samt för utvecklingen av nya behandlingsmetoder mot exempelvis cancer.
         I denna avhandling har reparation av dubbelsträngsbrott undersökts på molekylär nivå för att få en djupare inblick i hur specifika proteiner agerar då DNA-kedjan har gått av. Genom att tvinga in DNA i små kanaler, cirka tusen gånger smalare än diametern på ett hårstrå, är det möjligt att sträcka ut enskilda molekyler utan att hålla fast i ändarna. Därmed kan man visualisera hur olika proteiner binder till ändarna för att påbörja reparation av brottet. På så vis har vi lyckats identifiera en tidigare okänd potentiell funktion hos CtIP, ett protein som är nödvändigt för reparation av dubbelsträngsbrott i mänskliga celler. Vi har även studerat proteinet Ku som är en kritisk komponent, hos såväl människor som bakterier, i försvaret mot DNA-skador. För att även kunna studera dynamiska DNA-protein-interaktioner i realtid har vi vidareutvecklat de så kallade nanokanalerna för att möjliggöra aktiv tillförsel av proteiner till de utsträckta DNA-molekylerna. Avhandlingen i sin helhet sammanfattar några av de senaste framstegen som gjorts i syfte att förstå de invecklade DNA-reparationsprocesserna, vilket i förlängningen kan möjliggöra utvecklingen av nya och mer effektiva behandlingsmetoder mot exempelvis cancer.

Styrkeområden

Nanovetenskap och nanoteknik (SO 2010-2017, EI 2018-)

Livsvetenskaper och teknik (2010-2018)

Ämneskategorier

Biokemi och molekylärbiologi

Biofysik

Nanoteknik

ISBN

978-91-7905-343-7

Doktorsavhandlingar vid Chalmers tekniska högskola. Ny serie: 4810

Utgivare

Chalmers tekniska högskola

HA1-salen, Hörsalsvägen 4.

Online

Opponent: Prof. Erwin J. G. Peterman, Department of Physics and Astronomy, Vrije Universiteit, Netherlands

Mer information

Senast uppdaterat

2020-10-16