En nanofluidisk plattform för studier av biomolekyler på enkelmolekylnivå

Forskningsprojekt, 2012 – 2015

Projektet är inriktat mot att utveckla en plattform uppbyggd av nanokanaler för att sträcka ut och studera DNA/protein-komplex samt egenskaper hos och bildandet av amyloidfibriller. DNA är den molekyl som studerats mest i nanokanaler hittills. När DNA introduceras i en så trång kanal sträcks det ut spontant längs med kanalen och genom att färga in DNA med fluorescerande molekyler kan man studera dem en och en med fluorescensmikroskopi. Alla studier som gjorts på DNA i nanokanaler hittills har gjorts på DNA som är homogent infärgat för att synas tydligt i mikroskopet. Detta ger en tydlig bild av DNAt men har också sina nackdelar. De fluorescenta molekyler som används ändrar de fysiska egenskaperna hos DNA och tävlar med de proteiner som skall studeras om de lediga bindningssätena på DNA. Vi ska därför studera DNA/protein interaktioner i nanokanalerna med DNA som endast är fluorescent infärgat i ändarna. Även om systemet vi studerar är helt artificiellt så kan våra resultat hjälpa till att förstå hur DNA beter sig i små utrymmen i biologiska system, DNA är tätt packat i cellkärnan hos människor såväl som i virus och bakterier. Rekombinaser, som RecA från E. Coli. och Rad51 från eukaryota celler, bildar filament på DNA som kan vara flera mikrometer långa är utmärkta kandidater för inledande studier i nanokanaler. Genom ett samarbete har vi tillgång fluorescenta rekombinaser som gör att filamenten är tydlig synliga i nanokanalerna när de är bundna till DNA. Filamenten är mer än 10 gånger stelare än normalt DNA, vilket kommer visa sig i nanokanalstudierna som att de är mer orienterade längs med nanokanalen än DNA utan protein. Rekombinaser är viktiga för att laga skadat DNA och för att bibehålla den genetiska mångfalden. De fysiska egenskaperna på filamenten beror på vilken divalent jon och vilken kofaktor (ADP eller ATP) som är bunden till proteinet, en skillnad som är viktig för att förstå hur proteinet fungerar. Nanokanalerna är optimala för att kunna detektera den här typen av skillnader i fysiska egenskaper. Vi är även intresserade av att använda plattformen för att studera andra biomakromolekyler. Ett intressant exempel är amyloider som är långa fibriller av felveckade proteiner. Amyloider är av intresse för att de anses vara den bakomliggande orsaken för en mängd olika sjukdomar som till exempel Alzheimer?s och Parkinson?s. Eftersom amyloiderna är väldigt smala (ca 10 nm) och långa (upp till flera mikrometer) lämpar de sig utmärkt för studier i nanokanaler. Vårt nanofluidiska system gör det möjligt, genom att se på hur fibrillerna beter sig när man ändrar dimensionerna på kanalerna, att bestämma hur styva de är i lösning, något som varit svårt med tidigare metoder. Vi kommer att undersöka hur stor skillnad det är på de fysiska egenskaperna hos fibrerna beroende på vilket protein de är byggda av samt hur den omgärdande lösningen är sammansatt. Vi kommer också att studera hur amyloider bildas i nanokanalerna. Det trånga utrymmet inne i kanalerna liknar, som diskuterats ovan, den trängsel som finns inne i celler. Vi kan genom designen av det nanofluidiska chipet bestämma dimensionerna på kanalerna helt fritt vilket gör att vi kan bestämma väldigt exakt hur dimensionerna på kanalen påverkar bildandet av amyloider. Återigen är det av intresse at studera hur proteiner som är relaterade till olika sjukdomar beter sig och skiljer sig från varandra för att förstå den bakomliggande mekanismen. Vi vill även undersöka om det är möjligt att detektera biomolekyler i nanokanalerna utan att märka dem fluorescent. Nanoplasmonik, skiftet i extinktionsspektra hos en metall-nanopartikel när brytningsindex hos den omgivande lösningen ändras, är en känslig metod som kan appliceras på en enda partikel. Genom att placera en eller flera guldpartiklar väldigt nära kanalen kan vi därmed detektera när en biomolekyl som DNA eller amyloidfibrill passerar. Detektion av amyloider med nanoplasmonik kan visa sig intressant då fibrillering kan vara en väldigt långsam process. Det betyder att vi inte kan integrera vår signal över länge tider och därmed detektera mindre skift, vilket optimalt kan leda till att vi kan särskilja prefibrillära aggregat och mogna amyloider.

Deltagare

Finansiering

Mer information

Senast uppdaterat