Biofysikaliska undersökningar av utsträckta konformationer av nukleinsyror

Forskningsprojekt, 2016 – 2019

"Vi vill förstå den molekylära mekanismen för homolog DNA rekombination. Det gäller RecA, ett protein som flyttar runt gener i bakteriers DNA på ett ”intelligent” sätt - och som även kan reparera skadat DNA. ”Intelligent” betyder att enzymet blandar den genetiska koden utan att den blir meningslös. Bakteriers förmåga att mutera intelligent gör det möjligt för dem att snabbt ändra sig för att undvika fara (t ex skapa resistens mot antibiotika) eller utnyttja nya möjligheter. Även hos människor är rekombination viktig: för sexuell fortplantning, ett annat sätta att införa intelligenta mutationer. Här är det proteinet Rad51 som blandar mammans och pappans gener på ett intelligent sätt. Trots betydelsen av enzymen och många års forskning vet man fortfarande inte hur de fungerar på atomär nivå. Sådan kunskap skulle vara värdefull på en rad nivåer och t ex förklara saker som har med den tidiga utvecklingen av liv att göra, och även möjliggöra utveckling av nya läkemedel. Vi vet hur RecA binder sig till DNA: proteinmolekylerna bildar ett spiralformat rör som omsluter DNA-molekylen. En annan DNA-molekyl tar sig sedan in i röret och – hokus pokus! – så har ena DNA-strängen bytts ut. Vad har hänt medan ”ridån var nere”? Vi visade tidigt med polariserat ljus och neutronspridning att de fyra DNA-baserna sitter välordnade med sina plan vinkelrätt mot RecA-rörets längsriktning, medan DNA-molekylen inuti röret sträckts ut kraftigt, ungefär 1,5 ggr sin ursprungliga längd. Med förfinad metodik kunde vi bygga modeller, både med RecA och Rad51, och nyligen har också en kristallstruktur lösts där mer detaljer går att urskilja, dock utan att förklara något av funktionen. Varför DNA sträcks och hur baserna ändå kan förbli vinkelräta var en gåta i mer 20 år, när doktoranden Niklas Bosaeus för tre år sedan gjorde en upptäckt. Med teknik importerad från USA byggde Niklas en ”laserpincett” för att sträcka DNA fixerad till två plastkulor manipulerade med laserljus - en uppfinning från 70-talet som Steve Chu (Nobelpris 1997) använde för att fånga atomer. Man hade sträckt DNA i mer än 10 år och noterat att långt DNA sträcks ca 70 % men denaturerar.

Vad Niklas lyckades med som ingen gjort förut, var att systematiskt undersöka vad som händer om man varierar sträckkraften och bokstavskombina¬tionen av DNA-baserna. Han var också den förste som mätte på kort DNA (ca 50 baspar). Han upptäckte att vid en väldefinierad kraft (64 pN dvs 0,000000000064 Newton!) expanderade DNA-molekylen med en faktor 1,51 d v s blev 51% längre. Vid precis vid 64 pN hoppade den fram och tillbaka mellan kort och lång form, var fortfarande basparad och denaturerade aldrig. Detta var en viktig upptäckt som bevisar att det är fråga om en ny ”konformation”, en struktur som bestäms av termodynamikens lagar. Upptäckten var ett genombrott och nu vill vi försöka ta reda på mer, bl a hur övergången kan ske så snabbt som den gör, baserna verkar samarbeta. Men vad har nu detta med rekombination att göra? Jo, den sträckta formen av DNA inuti röret av RecA i bakterier eller Rad51 människa uppvisar exakt samma förlängning av DNA. Detta kan inte vara en tillfällighet! Miljoner år av utveckling av bakterier under Charles Darwins ”survival of the fittest” tror vi har utnyttjat en grundläggande fysisk egenskap hos DNA (och RNA). Självklart vill vi gärna veta vad som händer bakom ridån då enzymet säger hokus pokus! Har vi då någon strategi för det? Ja, vi har många finslipade verktyg till hands för att avslöja trolleriet! Med laser-pincetten kan vi sträcka DNA med olika sekvens och med en sorts häftklamrar användande ”klick-kemi” (Barry Sharpless, Nobelpris 2001) kan vi undersöka vad som händer om vi buntar ihop vissa baser. Vi tror nämligen att när DNA börjar sträckas sker något vi kallar ”disproportionering”: tre baser staplas på varandra som i en myntrulle följd av ett stort gap till nästa myntrulle o s v.

Våra experiment ska visa om vi har rätt eller fel. En annan upptäckt vi gjort är att vissa ”hydrofoba” (vattenhatande) molekyler verkar kunna katalysera strängutbyte mellan DNA-molekyler utan att RecA behövs. För att förstå rekombination på en ”atomistisk” nivå, d v s hur olika delar av protein och nukleinsyra interagerar, och även hur energibränslet ATP utnyttjas för att driva processen, behöver vi komplettera våra experiment med teoretiska beräkningar av energibarriärer för olika steg i processen, och även undersöka den möjliga rollen hos en hydrofob katalysator."