Amyloid Fibril Formation - Dye Detection and Effects of Lipids

David Lindberg

Amyloid Fibril Formation - Dye Detection and Effects of Lipids
Doktorsavhandling, 2017

Amyloid fibrils are long fibrillar homopolymers of self-assembled proteins. They can be formed by essentially any polypeptide, but are of particular interest because of their occurrence in several incurable and debilitating human diseases, e.g. Alzheimer’s disease (AD). A central pathological event in AD is build-up of amyloid fibrils by the amyloid-β (Aβ) peptide. This thesis describes my work in the field of biochemistry and biophysics to understand the molecular mechanisms and events that lead to amyloid fibril formation in general, and Aβ assembly in particular. One of the most widely used fluorescent dyes in amyloid research is thioflavin-T (ThT); despite this, its fibril-binding and fluorescent properties are not completely understood at a molecular level. In this thesis, I show that the binding of ThT to fibrils, and consequently its fluorescence, can vary depending on fibril morphology, and that ThT exhibits significant self-quenching at high binding density. These findings are important contributions to the understanding of how ThT functions as an amyloid dye, and can therefore help in the experimental design of biophysical assays involving ThT fluorescence. In addition, I also detail the use of YOYO-1 for amyloid fibril detection. Biogenesis of Aβ occurs in and around lipid-rich environments, and lipids have been proposed to have a central role in AD pathology. In this thesis I have investigated fibril-lipid interactions. I show that DOPC lipid vesicles augment Aβ fibril formation, and that they do so through interaction with growing fibrils, thereby reinforcing secondary mechanisms such as fibril fragmentation and secondary nucleation. This demonstrates how, on a molecular level, lipids may contribute to the pathogenesis of AD. Finally, I have studied amyloid fibril formation by the hormone insulin, a blood-glucose regulating protein used in treatment of diabetes. I demonstrate that mildly acidic solutions and presence of alcohols as co-solvents has a retarding effect on fibril formation. This has strong implications on the purification and long-term stability of pharmaceutical insulin.

atomic force microscopy

fluorescence

Alzheimer’s disease

YOYO-1

amyloid fibrils

lipids

linear dichroism

FRET

circular dichroism

kinetics

Protein aggregation

insulin

thioflavin-T

KA-salen, Kemigården 4

Opponent: Daniel Otzen, Aarhus University, Denmark

Författare

David Lindberg

Chalmers, Biologi och bioteknik, Kemisk biologi

Forskning Andra publikationer

Detection of amyloid-beta fibrils using the DNA-intercalating dye YOYO-1: Binding mode and fibril formation kinetics

Biochemical and Biophysical Research Communications,;Vol. 469(2016)p. 313-318

Artikel i vetenskaplig tidskrift

Steady-state and time-resolved Thioflavin-T fluorescence can report on morphological differences in amyloid fibrils formed by A beta(1-40) and A beta(1-42)

Biochemical and Biophysical Research Communications,;Vol. 458(2015)p. 418-423

Artikel i vetenskaplig tidskrift

David J. Lindberg, Emelie Wesén, Johan Björkeroth, Sandra Rocha & Elin K. Esbjörner - Lipid membranes catalyse the fibril formation of the amyloid-β (1-42) peptide through lipid-fibril interactions that reinforce secondary pathways

Basic, A.; Lindberg, D. J.: Limé, F.; Jageland, P.; Palmlöf, M. & Esbjörner, E. K. - Effect of Alcohols on Insulin Amyloid Formation at Moderately Acidic pH.

Amyloida fibriller består av felveckade proteiner som ansamlats i långa kedjor. De är mycket tunna, ofta bara ett par nanometer, men kan bli upp till tiotals mikrometer långa. Amyloida fibrillers egenskaper är särskilt intressanta eftersom de har kopplats till ett flertal obotliga och ofta dödliga mänskliga sjukdomar. Det vanligaste förekommande exemplet är den progressiva demenssjukdomen Alzheimers sjukdom, som är starkt kopplad till ansamling av amyloida fibriller i hjärnan. I Alzheimers sjukdom bildas så kallade senila plack runt nervcellerna. Dessa plack består av ett naturligt förekommande protein, amyloid-β (Aβ) och dess bildande av fibriller och plack sätter igång en kaskad av reaktioner som leder till att nervcellerna förtvinar och dör. Alzheimers sjudom är dödlig, och det finns i dagsläget inget fungerande botemedel.

Min avhandling handlar om att på en grundvetenskaplig nivå förstå hur amyloida fibriller bildas. Jag har använt mig av biokemiska och biofysikaliska metoder för att undersöka hur bildandet går till, vilka mekanismer som styr och hur olika molekyler påverkar processen. Jag har också studerat två fluorescerande färgämnen, thioflavin-T och YOYO-1, som kan användas för att experimentellt detektera amyloida fibriller och deras egenskaper. Thioflavin-T är ett klassiskt använt amyloid-färgämne, men jag har utvecklat dess användningsområde, samt bidragit till en bättre förståelse kring dess ljusemitterande egenskaper. YOYO-1 är ett nytt amyloid-färgämne som tidigare mestadels använts för att färga in DNA-molekyler. Vidare har jag studerat hur lipidmembran påverkar bildandet av amyloida fibriller av Aβ. Jag har visat att membran med den i hjärnan vanligast förekommande lipidhuvudgruppen (PC), katalyserar bildandet av amyloida Aβ-fibriller. Jag har också utvecklat en ny metod för att studera lipid-fibrill-interaktioner, baserad på fluorescensenergiöverföring (FRET). Slutligen har jag också studerat amyloidfibrillbildning av det blodsockerreglerande proteinet insulin. När insulin tillverkas i stor skala industriellt bildas aggregat i utrustningen som används för upprening. Jag har visat att man genom att optimera pH och genom tillsatts av lågmolekylära alkoholer som etanol i reningssteget kan minska fibrillbildningen för insulin väsentligt.

Ämneskategorier

Biokemi och molekylärbiologi

Biofysik

Medicinsk bioteknologi (med inriktning mot cellbiologi (inklusive stamcellsbiologi), molekylärbiologi, mikrobiologi, biokemi eller biofarmaci)

ISBN

978-91-7597-556-6

Doktorsavhandlingar vid Chalmers tekniska högskola. Ny serie: 4237

Utgivare

Chalmers