Prevention of hemolysis as a novel strategy to limit hemoglobin-mediated lipid oxidation in fish - towards a more sustainable use of fish raw materials
Doktorsavhandling, 2022
Hemoglobin (Hb) has been recognized as a main pro-oxidant in fish, causing fast and intense lipid oxidation. This thesis explores the hypothesis that maintaining red blood cells (RBCs) intact for an extended time during fish processing could delay Hb-mediated lipid oxidation. The aims were to (i) unravel how selected endogenous and exogenous parameters affect fish RBC-stability, (ii) confirm the relation between hemolysis and lipid oxidation and (iii), evaluate antioxidative strategies to prevent oxidation caused by released Hb.
In Study I, washed and resuspended trout RBCs (wr-RBC) and whole trout blood (WB) were used to study how temperature, salinity and mechanic pressure affect hemolysis. Cold temperatures, 0-6 °C, and physiological saline were advantageous for the RBC stability while hyper- (3% NaCl) or hypotonic (tap water) conditions as well as simulated mechanic pressure hemolysis. Study II revealed that typical post-mortem pH’s, 6.4 and 6.8, yielded a higher hemolysis rate of wr-RBCs compared to pH 7.2-8.0, and stimulated lipid oxidation of the RBC membrane. Similarly, in RBC-spiked washed cod mince (WCM), pH 6.4/6.8 stimulated both lipid oxidation and hemolysis compared to pH 7.2/7.6 (Study III). Hb-analyses of the soluble phase revealed that only low levels of released Hb (7.1 µM) were needed to initiate lipid oxidation at pH 6.4-6.8, which was not the case at high pH, even when >50% of the Hb was in the metHb form. In experiments with wr-RBCs, re-addition of blood plasma (12-75% v/w) largely increased the RBC stability (Study I-II). The stabilizing effect was partly ascribed to glucose, albumin, and ascorbic acid (AA). Adding blood plasma to the RBC-spiked WCM system 3% (v/w), delayed the onset of lipid oxidation at pH 6.8 with 3-4 days without delaying hemolysis; the latter most likely due to the high plasma dilution. To clarify the effect of hemolysis on WCM lipid oxidation, different ratios of intact and lysed RBCs were added to a WCM system at pH 6.8 (Study III). Samples with 25-100% lysed RBCs oxidized rapidly within the first day of storage, whereas the sample with 100% intact RBCs provided a 1-day delay in the onset of lipid oxidation. Further, the sample with initially fully intact RBCs resulted in 59.5± 2.9% and 48.1± 2.9% reduced maximum peroxide value (PV) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), respectively.
Short pre-incubation of herring co-products in 0.9% NaCl removed 6.6-18.0% of their Hb and slightly reduced the intensity of TBARS development during ice storage of the minced product, compared to pre-incubation in tap water or no pre-incubation (Study IV). Refrigerated storage of herring co-products while submerged in tap water, 0.9% NaCl or phosphate buffered saline (PBS) (pH 6.5 or 7.5) also reduced the lipid oxidation intensity compared to air-storage; however, without any effect from pH or salinity. When adding the commercial antioxidant mixture Duralox-MANC to the pre-incubation or submerging solutions (2% vs 0.5%) the lipid oxidation lag phase was largely prolonged; e.g., from < 1 day in controls to >6 days. Direct fortification of minced herring co-products with 0.5 % Duralox-MANC confirmed its antioxidative efficiency as lipid stability was prolonged from <1 day to >8 days.
Altogether, this thesis confirmed that delaying hemolysis can be a route to delay lipid oxidation. It also revealed that current conditions used in the early handling/processing of fish, such as subjection to crowding, pumping, refrigerated sea water (RSW)-storage or tap water rinsing do not favor RBC stability and call for adjustments to limit hemolysis; and thereby Hb-mediated lipid oxidation. Intact RBCs, presence of blood plasma and elevated pH’s delayed lipid oxidation in a WCM system, providing an important window of time which could allow for better utilization of blood-rich fish raw materials currently leaving the food chain. To further enhance the lipid stability of such materials, subjecting them to rosemary-derived antioxidants via pre-incubation, submerging or direct addition is recommended. Results presented can contribute to an increased robustness of our global food systems towards unprecedented challenges such as pandemics, war, and climate threats. They also contribute to the ongoing dietary protein shift in which aquatic foods as small pelagic fish and fish rest raw materials have an immense potential if correctly preserved by updated procedures.
In Study I, washed and resuspended trout RBCs (wr-RBC) and whole trout blood (WB) were used to study how temperature, salinity and mechanic pressure affect hemolysis. Cold temperatures, 0-6 °C, and physiological saline were advantageous for the RBC stability while hyper- (3% NaCl) or hypotonic (tap water) conditions as well as simulated mechanic pressure hemolysis. Study II revealed that typical post-mortem pH’s, 6.4 and 6.8, yielded a higher hemolysis rate of wr-RBCs compared to pH 7.2-8.0, and stimulated lipid oxidation of the RBC membrane. Similarly, in RBC-spiked washed cod mince (WCM), pH 6.4/6.8 stimulated both lipid oxidation and hemolysis compared to pH 7.2/7.6 (Study III). Hb-analyses of the soluble phase revealed that only low levels of released Hb (7.1 µM) were needed to initiate lipid oxidation at pH 6.4-6.8, which was not the case at high pH, even when >50% of the Hb was in the metHb form. In experiments with wr-RBCs, re-addition of blood plasma (12-75% v/w) largely increased the RBC stability (Study I-II). The stabilizing effect was partly ascribed to glucose, albumin, and ascorbic acid (AA). Adding blood plasma to the RBC-spiked WCM system 3% (v/w), delayed the onset of lipid oxidation at pH 6.8 with 3-4 days without delaying hemolysis; the latter most likely due to the high plasma dilution. To clarify the effect of hemolysis on WCM lipid oxidation, different ratios of intact and lysed RBCs were added to a WCM system at pH 6.8 (Study III). Samples with 25-100% lysed RBCs oxidized rapidly within the first day of storage, whereas the sample with 100% intact RBCs provided a 1-day delay in the onset of lipid oxidation. Further, the sample with initially fully intact RBCs resulted in 59.5± 2.9% and 48.1± 2.9% reduced maximum peroxide value (PV) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), respectively.
Short pre-incubation of herring co-products in 0.9% NaCl removed 6.6-18.0% of their Hb and slightly reduced the intensity of TBARS development during ice storage of the minced product, compared to pre-incubation in tap water or no pre-incubation (Study IV). Refrigerated storage of herring co-products while submerged in tap water, 0.9% NaCl or phosphate buffered saline (PBS) (pH 6.5 or 7.5) also reduced the lipid oxidation intensity compared to air-storage; however, without any effect from pH or salinity. When adding the commercial antioxidant mixture Duralox-MANC to the pre-incubation or submerging solutions (2% vs 0.5%) the lipid oxidation lag phase was largely prolonged; e.g., from < 1 day in controls to >6 days. Direct fortification of minced herring co-products with 0.5 % Duralox-MANC confirmed its antioxidative efficiency as lipid stability was prolonged from <1 day to >8 days.
Altogether, this thesis confirmed that delaying hemolysis can be a route to delay lipid oxidation. It also revealed that current conditions used in the early handling/processing of fish, such as subjection to crowding, pumping, refrigerated sea water (RSW)-storage or tap water rinsing do not favor RBC stability and call for adjustments to limit hemolysis; and thereby Hb-mediated lipid oxidation. Intact RBCs, presence of blood plasma and elevated pH’s delayed lipid oxidation in a WCM system, providing an important window of time which could allow for better utilization of blood-rich fish raw materials currently leaving the food chain. To further enhance the lipid stability of such materials, subjecting them to rosemary-derived antioxidants via pre-incubation, submerging or direct addition is recommended. Results presented can contribute to an increased robustness of our global food systems towards unprecedented challenges such as pandemics, war, and climate threats. They also contribute to the ongoing dietary protein shift in which aquatic foods as small pelagic fish and fish rest raw materials have an immense potential if correctly preserved by updated procedures.
hemoglobin
herring (Clupea harengus)
fish
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)
erythrocyte
hemolysis
side-stream
antioxidant
lipid oxidation
blood plasma
Chalmers Johanneberg Campus, Hall Gustaf Dahlénsalen, entrance from Chalmers Tvärgata 5
Opponent: Professor Edel Elvevoll, UiT, The Arctic University of Norway
Författare
Semhar Ghirmai
Chalmers, Biologi och bioteknik, Livsmedelsvetenskap
Improving the Stability of Red Blood Cells in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) and Herring (Clupea harengus): Potential Solutions for Post-mortem Fish Handling to Minimize Lipid Oxidation
Food and Bioprocess Technology,;Vol. 13(2020)p. 1344-1355
Artikel i vetenskaplig tidskrift
Exploring how plasma- and muscle-related parameters affect trout hemolysis as a route to prevent hemoglobin-mediated lipid oxidation of fish muscle
Scientific Reports,;Vol. 12(2022)
Artikel i vetenskaplig tidskrift
Ghrimai, S., A. Krona, H. Wu, M. Axelsson and I. Undeland. Relationship between hemolysis and lipid oxidation in washed cod mince spiked with red blood cells and its dependance on pH and blood plasma
Stabilization of herring (Clupea harengus) by-products against lipid oxidation by rinsing and incubation with antioxidant solutions
Food Chemistry,;Vol. 316(2020)
Artikel i vetenskaplig tidskrift
Stundande utmaningar som en växande befolkning, pandemi, krig och klimatförändringar sätter stora krav på de globala livsmedelssystemen och inte minst på användningen av livsmedelsråvaror. Processer som skapar stora mängder restråvaror behöver optimeras för att minimera matsvinn, och detta är särskilt viktigt inom fiskindustrin där stora mängder råvara lämnar livsmedelskedjan, antingen direkt eller efter att man tagit vara på fiskfilén. I Sverige står sill och skarpsill för ca. 70 % av den totala volymen vildfångad fisk, men bara drygt 11 % av detta når konsumenterna; resterande 89% används främst för produktion av fiskmjöl eller fiskolja. Det behövs därför en enorm transformation av fiskindustrin för att bättre tillvarata våra fiskråvaror till mat, vilket inkluderar både underutnyttjade arter och underutnyttjade delar från fisken.
Reaktionen mellan luftens syre och fett, så kallad fettoxidation, är den främsta kemiska orsaken till försämrad kvalité hos fisk då denna reaktion skapar härsken lukt och smak, försämrad textur och färg, samt nedbrytning av de värdefulla omega-3-festtsyorna och antioxidanterna i fisken. Forskning under de senaste två decennierna har tydligt visat att fiskens hemoglobin -det protein som är koncentrerat i de röda blodkropparna i blodet- främjar kraftig fettoxidation. Detta är ett stort problem i just sill, skarpsill och restråvaror som alla är blodrika. Denna doktorsavhandling har utforskat hur man kan hålla fiskens röda blodkroppana intakta under längre tid så att hemoglobinet ej läcker ut och kan reagera med fettet. Den har också utforskat om man med antioxidanter kan hämma oxidation initierad av hemoglobin.
Studier i fyra olika modellsystem (helblod, tvättade röda blodkroppar, tvättad torskfärs och restråvaror från sillindustrin) har bekräftat hypotesen att fördröjd så kallad ”lysering” av röda blodkroppar kan förhala fettoxidation. Resultaten har också visat att processparametrar som ofta appliceras inom fiskindustrin behöver justeras för att undvika att de röda blodkropparna lyserar. Exempelvis fann vi att kranvatten, havsvatten, förhöjt tryck, temperatur >6 °C och lågt pH alla stimulerade lysering. Blodplasma fördröjde däremot både lysering och fettoxidation. Utvalda komponenter i såväl blodplasma som i blodstabiliserade lösningar använda inom transfusionsmedicin studerades därför, men nådde inte samma goda effekt som fiskens egen blodplasma.
En djupare analys av kopplingen mellan pH, lysering och fettoxidation visade att det lägre pH (6.4–6.8) som uppstår i fisken efter död stimulerade både oxidation av membranet runt de röda blodkropparna och dess lysering, jämfört med pH 7.2–8.0. När de röda blodkropparna blandades in i tvättad torskfärs observerades också att lågt pH gav en mycket snabbare fettoxidation jämfört med pH 7.2–7.6. Studier i detta system visade också att endast minimal lysering av de röda blodkropparna räckte för att en kraftig fettoxidation skulle uppstå. Ytterligare strategier undersöktes därmed för att hämma fettoxidation stimulerad av hemoglobin. I dessa försök användes sillrestråvaror, och de mest effektiva strategierna var att kort inkubera dessa i en antioxidantlösning eller helt enkelt lagra dem i en sådan lösning i kyla. Med dessa metoder förlängdes tiden innan oxidationen startade från <1 dag till >7 dagar!
Sammantaget bidrar denna doktorsavhandling med nya kunskaper för att mer effektivt hindra fettoxidation i fisk i ett tidigt skede efter fångst, och på så sätt behålla mer av våra fiskråvaror inom livsmedelskedjan för en mer hållbar livsmedelsproduktion.
Reaktionen mellan luftens syre och fett, så kallad fettoxidation, är den främsta kemiska orsaken till försämrad kvalité hos fisk då denna reaktion skapar härsken lukt och smak, försämrad textur och färg, samt nedbrytning av de värdefulla omega-3-festtsyorna och antioxidanterna i fisken. Forskning under de senaste två decennierna har tydligt visat att fiskens hemoglobin -det protein som är koncentrerat i de röda blodkropparna i blodet- främjar kraftig fettoxidation. Detta är ett stort problem i just sill, skarpsill och restråvaror som alla är blodrika. Denna doktorsavhandling har utforskat hur man kan hålla fiskens röda blodkroppana intakta under längre tid så att hemoglobinet ej läcker ut och kan reagera med fettet. Den har också utforskat om man med antioxidanter kan hämma oxidation initierad av hemoglobin.
Studier i fyra olika modellsystem (helblod, tvättade röda blodkroppar, tvättad torskfärs och restråvaror från sillindustrin) har bekräftat hypotesen att fördröjd så kallad ”lysering” av röda blodkroppar kan förhala fettoxidation. Resultaten har också visat att processparametrar som ofta appliceras inom fiskindustrin behöver justeras för att undvika att de röda blodkropparna lyserar. Exempelvis fann vi att kranvatten, havsvatten, förhöjt tryck, temperatur >6 °C och lågt pH alla stimulerade lysering. Blodplasma fördröjde däremot både lysering och fettoxidation. Utvalda komponenter i såväl blodplasma som i blodstabiliserade lösningar använda inom transfusionsmedicin studerades därför, men nådde inte samma goda effekt som fiskens egen blodplasma.
En djupare analys av kopplingen mellan pH, lysering och fettoxidation visade att det lägre pH (6.4–6.8) som uppstår i fisken efter död stimulerade både oxidation av membranet runt de röda blodkropparna och dess lysering, jämfört med pH 7.2–8.0. När de röda blodkropparna blandades in i tvättad torskfärs observerades också att lågt pH gav en mycket snabbare fettoxidation jämfört med pH 7.2–7.6. Studier i detta system visade också att endast minimal lysering av de röda blodkropparna räckte för att en kraftig fettoxidation skulle uppstå. Ytterligare strategier undersöktes därmed för att hämma fettoxidation stimulerad av hemoglobin. I dessa försök användes sillrestråvaror, och de mest effektiva strategierna var att kort inkubera dessa i en antioxidantlösning eller helt enkelt lagra dem i en sådan lösning i kyla. Med dessa metoder förlängdes tiden innan oxidationen startade från <1 dag till >7 dagar!
Sammantaget bidrar denna doktorsavhandling med nya kunskaper för att mer effektivt hindra fettoxidation i fisk i ett tidigt skede efter fångst, och på så sätt behålla mer av våra fiskråvaror inom livsmedelskedjan för en mer hållbar livsmedelsproduktion.
Drivkrafter
Hållbar utveckling
Ämneskategorier
Cellbiologi
Biokemi och molekylärbiologi
Biologiska vetenskaper
Annan kemi
Kemi
Fundament
Grundläggande vetenskaper
Styrkeområden
Hälsa och teknik
ISBN
978-91-7905-716-9
Doktorsavhandlingar vid Chalmers tekniska högskola. Ny serie: 5182
Utgivare
Chalmers
Chalmers Johanneberg Campus, Hall Gustaf Dahlénsalen, entrance from Chalmers Tvärgata 5
Opponent: Professor Edel Elvevoll, UiT, The Arctic University of Norway